随着国内经济的迅猛发展,对石油的依赖程度不断加大,而我国石油资源匮乏,因此大庆页岩油的开发逐渐提上日程,页岩油泥作为页岩油开发过程中的主要污染物,对环境的危害日渐严重。页岩油泥中含有大量的单环芳烃,采用传统的物理及化学方法降解困难。微生物降解单环芳烃成本低、占地少、且对环境危害小,逐渐成为页岩油泥降解研究的重点方向。 本研究对大庆地区页岩油泥的成分进行分析,选取单环芳烃中占比较高的乙苯和四氢萘作为碳源,对页岩油泥中的菌群进行驯化培养。采用宏基因组技术对降解菌群进行筛选和鉴定,通过高效气相色谱对筛选菌群的降解率进行检测。筛选得到最佳降解菌群后,进行降解温度、p H、接菌量和外加碳源等培养条件的优化。为了加强菌群降解能力,构建邻苯二酚双加氧酶的基因工程菌。将菌群与基因工程菌进行复合,观察降解页岩油泥的效果,结果如下所示: 1.采用不同浓度的乙苯和四氢萘(100~800 mg/L)作为碳源,对页岩油泥进行逐级驯化,获得5组菌群。宏基因组对菌群分析结果显示,随着乙苯及四氢萘浓度的逐渐增加,菌群的物种丰富性和多样性显著下降。对菌群的降解率检测表明,2代菌群的降解能力最佳,对500 mg/L乙苯48 h降解率为98.5%,对500 mg/L四氢萘48 h降解率为95.0%,选取2代菌群作为后续的实验菌群。2代菌群主要的优势菌属为泛菌属及假单胞菌属。 2.降解菌群的单因素条件优化结果表明,当p H为6-7,温度为25-30℃,接菌量为10~9CFU/m L-10¹⁰CFU/m L,外加碳源葡萄糖的终浓度为50 mg/L时,菌群的降解率最高。添加50 mg/L葡萄糖对菌群的降解有促进作用。响应面优化条件为温度30℃、p H 7、接菌量10~9 CFU/m L,在上述条件下降解率为78.21%。 3.根据宏基因组结果,筛选到邻苯二酚1,2双加氧酶(cat A)构建重组大肠杆菌E.coli/p ET-28a-cat A和重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800/p HY-P43-cat A,E.coli/p ET-28a-cat A对乙苯和四氢萘降解率分别为73.2%、37.3%,B.subtilis WB800/p HY-P43-cat A对乙苯和四氢萘降解率分别为82.9%、81.3%。重组枯草芽孢杆菌对乙苯、四氢萘的降解率比重组大肠杆菌分别提高9.9%、44.0%,因此在后续应用实验中选择重组枯草芽孢杆菌进行复配。 4.将菌群与重组枯草芽孢杆菌进行复配,经过28 d连续对页岩油泥进行检测,菌群(搅拌组)降解率最高可以达到56.4%,菌群+基因工程菌组降解率最高可以达到62.3%。对比单独菌群,菌群+基因工程菌对页岩油泥的28 d降解率提高了5.9%。 综上,本降解实验的结果为大庆页岩油开采产生的页岩油泥治理提供了菌群资源,所获得的菌群及基因工程菌具有规模化处理页岩油泥的降解能力。