背景:激素性股骨头坏死(Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH)确切发病机制不明,至今尚未有令人满意的方法来增加股骨头坏死区的血液循环,促进骨再生,防止骨坏死。随着基因治疗技术的飞速发展,以血管生成和骨再生为特点的基因治疗成为SANFH治疗的新选择。目的:将具有成血管作用及促成骨分化作用的miRNA-126及miRNA-210包装于重组腺相关病毒,通过系列体外实验明确其介导基因表达的时效性、生物学活性,为进一步研究SANFH提供新的理论依据和防治策略。方法:1.应用密度梯度离心联合贴壁筛选法,分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs);应用HE染色、细胞表面抗原流式细胞学、诱导成骨及成脂分化等综合方法鉴定。2.利用荧光细胞计数法检测重组腺相关病毒载体感染BMSCs的最佳感染复数;利用MTT实验检测最佳感染复数下对BMSCs细胞增殖活性的影响。3.将重组腺相关病毒载体以最佳感染复数感染BMSCs细胞,于不同时间点分别应用倒置荧光显微镜观察BMSCs细胞EGFP表达,明确其体外介导基因表达的时效性特点。4.将四组重组腺相关病毒载体(AAV-EGFP组、AAV-miR-126组、AAV-miR-210组及AAV-miR-126/miR-210组)感染BMSCs细胞后6d细胞上清液作为诱导培养液;应用诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)管状血管形成实验检测体外成血管生物学活性;应用诱导BMSCs成骨矿化实验检测体外成骨生物学效应。结果:1.细胞生长呈典型的成纤维样,漩涡状生长;细胞表面抗原流式细胞学鉴定显示CD29、CD44、Vimentin等干细胞系标记均一高表达(细胞阳性率≥96%~99%),CD34、CD45等造血系标记为阴性(细胞阳性率≤2%);多向诱导分化鉴定ALP Gomori钙钴法染色及油红“O”染色阳性。2.重组AAV感染BMSCs的最佳感染复数为105vg/cell;在最佳感染复数下,BMSCs细胞增殖无显著变化。3.随感染时间的延长,6d为重组AAV体外介导基因表达的峰值时间段。4.体外成血管活性检测,AAV-EGFP组、AAV-miR-126组、AAV-miR-210组及AAV-miR-126/miR-210组,管状血管数分别为6.80±2.57、18.30±3.86、7.20±4.62及25.70±5.27个/mm2,AAV-miR-126/miR-210组管状血管数目明显高于AAV-EGFP组、AAV-miR-126组、AAV-miR-210组,差异均有统计学意义(P< 0.05);AAV-miR-126组管状血管数目明显高于AAV-EGFP组和AAV-miR-210组,差异均有统计学意义(P< 0.05);AAV-EGFP组和AAV-miR-210组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。体外成骨分化活性检测,AAV-EGFP组、AAV-miR-126组、AAV-miR-210组及AAV-miR-126/miR-210组矿化结节数分别为1.90±0.97、1.99±0.62、5.42±1.23及5.90±1.00个/mm2,AAV-miR-210组及AAV-miR-126/miR-210组数钙化结节数目明显高于AAV-EGFP组和AAV-miR-126组,差异均有统计学意义(P< 0.05);AAV-EGFP组与AAV-miR-126组间、AAV-miR-210组与AAV-miR-126/miR-210组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)。结论:1.本实验获得的兔骨髓来源的BMSCs纯度较高,符合BMSCs细胞的生物学特征。2.重组腺相关病毒载体感染兔BMSCs的最佳感染复数为105vg/cell ;在最佳感染复数下,重组腺相关病毒载体对BMSCs细胞增殖活性无显著影响。3.本实验中,重组腺相关病毒载体在体外介导基因表达具有优良的时效性。4.在本实验中,双基因共表达组AAV-miR-126/miR-210组较单基因表达组AAV-miR-126组和AAV-miR-210组能够产生更强、更有效的成骨及血管生成效应,miR-126和miR-210在生物学活性产生上是相互协调、相互促进的。