人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)是一类来源于牙髓组织成体间充质干细胞,具有高度增殖和多向分化潜能的特性,因其取材方便、创伤小和免疫原性低等特点,已成为牙齿再生及组织工程中极有应用价值的种子细胞。低氧能够影响干细胞增殖、分化、凋亡及损伤修复等生物学进程。牙髓组织由于其特殊的解剖结构,当受到外部刺激如外伤、炎症等时,易引起缺血和低氧。已有的牙髓干细胞低氧相关研究表明,低氧状态会引起牙髓组织的防御性反应,并影响牙髓干细胞的增殖等生物学行为。作为一种高度保守的信号通路,Notch信号通路在细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。我们课题组已经发现低氧环境可以引起胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)中Notch信号通路活性增加,进而提高GSCs的增殖和自我更新能力,提示低氧对GSCs的影响可能是通过激活Notch信号通路来实现的。那么低氧环境下HDPSCs生物学性状会发生怎样的改变,Notch信号通路又是否在其中发挥作用呢?本课题借助MTT、克隆形成实验、茜素红染色、ALP活性检测、油红O染色、qpcr检测相关基因表达水平以及流式细胞术比较人牙髓干细胞在常氧和低氧条件下的增殖和分化能力的改变,并研究notch信号通路在其中的作用,以探究低氧对牙髓干细胞影响和机制,为进一步认识牙髓损伤修复机制并为牙髓干细胞在组织工程中应用提供依据。方法:1、hdpscs的分离、培养及鉴定:利用酶消化法和有限稀释法原代培养hdpscs,流式细胞术鉴定干细胞表面标记物,定向诱导分化鉴定细胞分化潜能。2、notch信号通路对人牙髓干细胞增殖与分化能力的影响:在hdpscs培养体系中加入notch通路阻断剂gsi,通过mtt细胞增殖实验、克隆形成实验、矿化和成脂诱导、茜素红染色、alp活性检测、油红o染色、相关基因表达水平的检测等实验观察比较notch信号通路阻断对hdpscs增殖与分化能力的影响。3、低氧对人牙髓干细胞增殖与分化能力的影响:应用二氯化钴(cocl2)模拟体外细胞低氧环境,通过mtt细胞增殖实验、矿化和成脂诱导、茜素红染色、alp活性检测、油红o染色、相关基因表达水平的检测以及流式细胞术等实验观察比较常氧和低氧条件对hdpscs增殖与分化能力的影响。4、低氧环境下notch信号通路阻断对人牙髓干细胞增殖与分化能力的影响:通过mtt细胞增殖实验、矿化和成脂诱导、茜素红染色、alp活性检测、油红o染色、相关基因表达水平的检测以及流式细胞术等实验观察低氧条件下notch信号通路阻断对hdpscs增殖与分化能力的影响,分析notch信号通路在其中所发挥的介导作用。结果:1、在体外成功分离和培养hdpscs,显微镜下观察可见贴壁细胞多呈梭形或多角形成纤维样细胞克隆,胞体伸展良好、胞浆均匀、核圆、核仁清晰;免疫荧光实验结果显示nestin、gfap表达阳性;流式细胞鉴定结果显示间充质干细胞的标志物stro-1、cd90、cd105以及血管内皮细胞标记分子cd146在hdpscs上均为高表达,而造血系标志物cd45及内皮系标志物cd31为不表达。传代扩大培养后的hdpscs经矿化诱导后经茜素红染色显示为红染的圆形小结节,同时alp活性也随矿化诱导时间增加而升高;经成脂分化诱导两周后显微镜下观察逐渐可见有脂滴形成,油红-o染色呈阳性反应,提示我们获得的hdpscs具有良好的增殖能力与多向分化潜能。2、notch信号通路对hdpscs增殖与分化能力的影响:(1)notch通路阻断剂gsi抑制hdpscs中notch信号通路活性:加入notch通路阻断剂gsi,hdpscs的notch下游靶基因hes1表达水平相比未加gsi的对照组细胞显著降低,说明经gsi处理后的hdpscs中notch信号通路活性被抑制。(2)notch信号通路对hdpscs的影响:荧光定量反转录pcr结果显示,notch信号通路阻断后hdpscs的干性分子oct4和c-myc的表达显著降低;mtt和细胞克隆形成实验结果显示notch通路阻断后的hdpscs增殖与克隆形成率下降(p<0.05),提示notch信号通路阻断可抑制hdpscs增殖能力;经矿化诱导并加入gsi后的hdpscs经茜素红染色镜下可见红色矿化结节显著多于对照组(p<0.05),alp活性也明显高于对照组(p<0.05),成骨相关基因runx2、ocn和成牙本质相关基因dspp的表达水平明显高于对照组(p<0.05);经成脂诱导并加入gsi后的hdpscs经油红-o染色呈阳性反应,且成脂相关基因pparγ的表达水平明显高于对照组(p<0.05),提示经gsi处理后的hdpscs的成骨和成脂的诱导分化能力增强。以上结果提示notch信号有助于促进牙髓干细胞增殖但抑制细胞分化。3、低氧对hdpscs增殖与分化能力的影响:反转录pcr和westernblot实验结果显示,低氧诱导因子hif-1α分子的表达随着cocl2浓度增加而升高,表明cocl2可以有效模拟低氧环境并具有剂量效应;通过实时荧光定量反转录pcr实验检测干细胞相关分子的rna表达水平,结果显示:低氧条件下hdpscs的干性分子oct4和c-myc的表达较常氧条件下明显上调(p<0.05);mtt实验结果显示:低氧可以促进hdpscs的细胞增殖(p<0.05);流式细胞检测结果显示:低氧条件下hdpscs的g1期细胞比例较常氧条件下显著降低(p<0.05);Annexin V/PI双染法检测的结果显示低氧对HDPSCs细胞凋亡并无显著影响(P>0.05);诱导分化实验结果显示:HDPSCs在低氧状态下表现为分化能力减弱。以上结果说明低氧培养环境促进牙髓干细胞增殖但抑制细胞分化。4、低氧条件下阻断Notch信号通路对HDPSCs增殖与分化能力的影响:实时定量PCR检测结果显示Notch下游靶基因Hes1的表达水平随着CoCl2浓度的增加而上升,提示在CoCl2模拟低氧环境下,Notch信号通路被激活。MTT实验结果显示:Notch信号通路阻断后低氧对HDPSCs的细胞增殖的促进作用被抑制(P<0.05);流式细胞检测结果显示:低氧条件下Notch信号通路阻断后HDPSCs的G1期细胞比例又显著上升(P<0.05);Annexin V/PI双染法检测的结果显示Notch信号通路阻断对HDPSCs细胞凋亡并无显著影响(P>0.05)。当Notch信号通路阻断后,低氧上调HDPSCs Oct4和C-myc表达以及抑制细胞分化的作用被逆转(P<0.05)。以上结果表明Notch信号通路介导低氧对牙髓干细胞的作用。结论:Notch信号通路参与维持HDPSCs的干性;低氧对人牙髓干细胞有促进增殖,增强干性以及抑制分化的作用;阻断Notch信号通路后可有效抑制低氧对HDPSCs细胞干性、增殖和分化能力的影响,提示低氧对人牙髓干细胞增殖与分化的影响作用可能是与Notch信号通路的激活有关。对于低氧影响牙髓干细胞增殖与分化功能的详细机制,后续研究将从低氧诱导因子Hif-1α和Hif-2α与NICD的相互作用着手,进一步讨论低氧激活Notch信号通路的分子机制,以深入探究低氧对牙髓干细胞影响和机制。