我国油页岩资源非常丰富。在油页岩形成的漫长生物转化过程中,微生物扮演着非常重要的角色。虽然如此,目前有关我国油页岩矿区微生物资源的现状却缺乏调查和认识。在本研究中,我们利用构建克隆文库、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、荧光原位杂交(FISH)、稀释平板培养和Biolog等技术手段,调查并研究油页岩沉积物以及油页岩沉积物周围环境中存在的微生物种类及其多样性情况。 利用克隆文库的方法,建立了6个克隆文库:三个采样油页岩矿区——辽宁抚顺矿、吉林桦甸矿和广东茂名矿,每个矿区分别建立了1个细菌克隆文库和1个真菌克隆文库。利用PCR-DGGE和FISH,分析了9个样品的细菌多样性以及样品中细菌和古细菌等微生物的相对丰度:三个采样油页岩矿区,每个矿区各选择3种类型环境样品,这些样品包括砂土、新鲜油页岩和风化油页岩或砂砾岩。 通过克隆文库和PCR-DGGE分析表明,细菌群落或真菌群落在门的分类层次上,三个矿区的构成类群均差异不大,但数量比例均差异很大;在属的分类层次上,任何两个矿区之间都存在很大的差异。除不可分类的微生物外,三个矿区的细菌门类共涉及变形菌门(Alpha-、Beta-、Gamma-)、厚壁菌门、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、异常球菌-栖热菌门和绿弯菌门,且它们很多为已报道的碳氢化合物降解菌属;各矿区细菌多样性总体较好,相对而言茂名矿的细菌多样性略低;三个矿区的共有菌门和优势菌门是变形菌门和厚壁菌门,共有菌属和优势菌属是假单胞菌属。而真菌群落的组成结构则较简单,即各矿区均以子囊菌门为优势菌,此外抚顺矿和桦甸矿还具有一定比例的担子菌门。微生物在油页岩矿区环境中的适应性进化可能是受到油页岩内在特性和矿区外在环境因素共同作用的驱动。 利用FISH的方法,统计了三个采样矿区上述各类型样品中细菌和古细菌的相对丰度。结果表明,细菌在各样品中的相对丰度均在50%以上,是数量上的优势类群,而古细菌的相对丰度均在5%以下,是数量上的劣势类群;新鲜油页岩样品中,细菌和古细菌的相对丰度均最高,明显高于同矿区的砂土和风化油页岩(或砂砾岩);不同矿区样品的细菌相对丰度也存在差异,抚顺矿相对较低,桦甸矿相对较高,而古细菌反之。结合油页岩的有机质性质来看,细菌或古细菌的相对丰度与油页岩干酪根类型以及油页岩中O/C元素比无关。 利用稀释平板培养的方法,我们继代培养了三个采样矿区油页岩样品中的细菌和真菌菌株。桦甸矿、茂名矿和抚顺矿分别分离到5株、5株和9株细菌,它们属于泛菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、微杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、中华单胞菌属、葡萄球菌属和不动杆菌属;同时,在上述三个矿区分别分离到11株、5株和6株真菌,它们属于德巴利氏酵母属、鬼伞属、红酵母属、Eucasphaeria、曲霉属、锁掷酵母属、丛赤壳属、生赤壳属、假丝酵母属、青霉菌属、正青霉属、枝孢属、链格孢属和隐球菌属,以及子囊菌门和担子菌门中可能为新发现类群的或者暂时无法确定菌属的真菌。 在本研究的准备阶段,为了能够顺利进行上述主体部分的实验,我们对实验中涉及到的DNA提取方法,以及PCR-DGGE使用的引物和FISH杂交反应的条件进行了探索和优化。首先,以油页岩及其矿区环境样品作为实验材料,采用十二烷基硫酸钠(SDS)高盐提取法、SDS液氮研磨提取法、SDS反复冻融提取法、SDS异硫氰酸胍提取法和试剂盒提取法分别对样品中的微生物总DNA进行提取。结果表明,SDS高盐提取法是一种简便且适合于油页岩样品的方法,该法所提取总DNA其纯度能够满足后续PCR等分子操作的要求,从而建立了适合于油页岩样品的微生物总DNA提取方法。其次,为了筛选出适应于PCR-DGGE技术分析油页岩细菌多样性的最佳引物,以968F/1401R、338F/518R、341F/907R和1055F/1406R共4组引物分别对细菌16S核糖体RNA基因(16S rDNA)的V6-V8、V3、V8和V9区靶序列进行了PCR-DGGE。结果表明,与其他两组引物相比,利用968F/1401R和338F/518R获得的DGGE指纹图谱物种丰富度指数更高、检出的细菌类群更丰富,较适合油页岩样品。最后,通过设置多组比对实验来确定效果最佳的FISH技术条件。结果表明,TRIzol和溶菌酶共处理的方式能够明显提高探针与目标生物细胞内靶核酸序列的杂交率,且当杂交温度46℃、杂交时间2.5 h、杂交液中去离子甲酰胺浓度20%时,杂交率接近100%,荧光亮度明亮、均匀,是一组较为理想的杂交反应条件。 在本研究的最后阶段,我们应用Biolog方法,探索性的分析了辽宁抚顺矿油页岩微生物对于不同类型碳源的代谢功能多样性。研究显示,革兰氏阴性细菌群落和革兰氏阳性细菌群落均对氨基类碳源利用较好,其次是羧酸类以及糖和糖衍生物,而对磷酸糖利用较差。连续多点测算多样性指数表明,微生物群落的碳代谢功能多样性总体较高,但随着培养时间的增加略有降低。