嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)作为生物浸出过程的典型优势菌株,在生物浸出过程中发挥重要作用。在铜矿资源的生物浸出后期,体系中存在大量的Cu²⁺,浸矿微生物能够耐受较高浓度的Cu²⁺是发挥其浸出作用的重要前提。前期课题组获得铜离子耐受较强的A.caldus,研究表明在极端的铜离子胁迫下,A.caldus会产生胞外聚合物(EPS),EPS已被证明可通过与重金属离子结合(如Cu²⁺、Pb²⁺和Zn²⁺等)起到渗透屏障的作用,阻止重金属离子渗入细胞从而降低重金属离子的毒性,然而其铜耐受机制仍有待深入解析。本研究以A.caldus来源的MarR家族与EPS相关的转录因子(命名为EpsR^Ac)为对象,对EpsR^Ac的性质、铜离子调控方式以及调控机制进行了探究,为A.caldus的耐铜机制提供新思路,为构建高效耐铜浸矿微生物基因工程菌株提供了理论依据。主要研究内容如下:(1)对A.caldus来源的epsR基因进行鉴定。生物信息学分析发现在Acidithiobacillus属中EpsR有保守的Cys残基,Cys残基被认为是潜在的Cu(Ⅰ)结合位点,推测其与铜离子的结合有关。通过启动子在线预测网站预测epsR基因的启动子,其中在E.coli DH5α中PⅠ启动子表现出最高的活性,为阴性对照的1.89倍。重金属离子参与了EpsR^Ac的转录调控,与未添加金属离子的实验组相比,在金属离子存在(Zn²⁺除外)下E.coli DH5α(pUD19-ProⅠ-EGFP)荧光强度强度增长率降低。由于含有PⅠ启动子的菌株能够较强的响应不同的重金属离子,推测PⅠ启动子存在EpsR^Ac的结合位点。(2)Cu(Ⅱ)直接与蛋白结合参与EpsR^Ac蛋白调控。E.coli BL21(DE3)用于EpsR^Ac的可溶性过表达,培养基中加入不同浓度的铜离子培养后蛋白与铜离子进行共纯化,未发现蛋白中铜离子含量增加,且共纯化蛋白的紫外吸收光谱也未发现吸收值的增加,而体外铜滴定实验发现每摩尔EpsR^Ac单体能结合0.667摩尔的Cu(Ⅰ),EpsR^Ac能够与Cu(I)结合,但其铜离子竞争力较弱。同时共纯化蛋白的圆二色光谱中α螺旋特征峰下降,铜离子的加入对蛋白的二级结构组成产生了影响。(3)EpsR^Ac能够与自身启动子结合且负调控自身基因的表达。EpsR^Ac在体外能够与自身基因启动子结合,但并未与邻近与EPS合成分泌有关基因的启动子结合。双质粒系统验证EpsR^Ac负调控自身基因的表达,且Cu(Ⅱ)能够减缓这种负调控作用。通过DnaseⅠ足迹实验初步确定了EpsR^Ac与PⅠ启动子具体的DNA结合序列TGTTCATCGTGTGAGCACACA(含回文序列),并通过MEME网站预测了A.caldus基因组中EpsR^Ac结合的其他靶点。