微生物暗发酵产氢以其原料利用的多样性、可再生性和廉价性,已成为21世纪重要的氢能生产方式。添加金属纳米颗粒和固定化微生物细胞均为近年来报道的促进暗发酵产氢的重要调控方式,然而此两种方式的耦合调控研究却鲜见报道。桃胶是多糖含量高的天然原料,吸附性能强,具备作为包埋载体的基本特性,可望用作新型的固定化载体,并且桃胶中丰富的生物活性物质亦使其可作为金属纳米颗粒绿色合成的天然原料。基于此,本研究以天然桃胶为原料,绿色合成磁性Fe₃O₄纳米颗粒,并耦合桃胶固定化Klebsiella sp.细胞,探讨其对菌株生物氢合成和木质纤维素水解液利用的调控作用,进一步通过对菌株氢酶活性的监测、活细胞数的对比分析及关键酶基因表达的实时定量PCR检测初步揭示该新型产氢调控方式的作用机制。具体研究内容如下:1.首先,以天然桃胶为原料,加入一定浓度的Fe²⁺、Fe³⁺进行反应,制备出磁性Fe₃O₄纳米颗粒,通过SEM、TEM、VSM、XRD及FTIR表征分析,结果显示,XRD表征分析,样品中的衍射峰尖锐,没有其他衍射峰,清楚的表明制备产物是高度结晶的,与JCPDS No.19-0629的标准磁铁矿XRD图谱吻合较好。SEM与TEM显示Fe₃O₄纳米颗粒呈球形,有轻微团聚,可能是由于纳米颗粒之间的磁吸引力造成的。2.其次,研究了不同浓度下磁性Fe₃O₄纳米颗粒对Klebsiella sp.发酵制氢特性的影响,结果显示,添加10-50 mg/L磁性Fe₃O₄纳米颗粒均能促进菌株产氢量的提高,尤其是添加浓度为20 mg/L时,Klebsiella sp.的最高产氢量可达4455.21±31.25 m L/L,较之对照处理(无纳米颗粒添加)提高约29.61%,表明该添加浓度具有较强的促产氢效应;且在该添加浓度下,OD₆₀₀增加值(△OD₆₀₀)和生物氢合成效率Y(H₂/S)亦最高,较对照处理分别提高9.87%和30.12%。3.制备的磁性Fe₃O₄纳米颗粒,按一定浓度添加至桃胶固定化剂中,用于Klebsiella sp.细胞固定化。SEM表征结果显示,固定化凝胶珠形成了交联的网状立体结构,细菌细胞均匀分布其中。研究了不同浓度磁性Fe₃O₄纳米颗粒耦合桃胶固定化对Klebsiella sp.发酵产氢特性的影响,结果表明,固定化处理下菌体存活时间得到延长,活细胞数迅速下降时间较未固定化处理延迟24 h;并且固定化处理的产氢量显著提高,其耦合添加5-25 mg/L磁性Fe₃O₄纳米颗粒的处理均可促进生物氢的合成,尤以添加浓度为10 mg/L的累积产氢量最高,可达5903±85 m L/L,较对照组提高约71.73%;此外,上述固定化处理亦有利于菌株利用木质纤维素水解液的还原糖,使得葡萄糖和木糖消耗率均达96.06%以上。4.测定了暗发酵生物制氢过程中Klebsiella sp.活菌数随时间的变化情况。结果显示,固定化处理下其单个凝胶珠(pcs)中活菌数量在24 h时达到最佳,为(2.21±0.02)×10¹⁰ cfu/pcs,远高于对照组,表明了固定化处理有利于对菌体的存活。通过对氢酶和甲酸氢裂解酶酶活检测,确定了添加10 mg/L纳米颗粒进行固定化对酶活具有较高的影响,氢酶和甲酸氢裂解酶酶活分别为达13.32±0.23μg/L/h和93.32±1.63μg/L/h,较不添加纳米颗粒固定化处理分别提高35.50%和19.15%。因此,进而利用实时定量PCR(RT-PCR)检测技术,通过对Klebsiella sp.的4个氢化酶基因、3个甲酸氢裂解酶基因的表达情况进行检测分析,结果显示,添加20 mg/L Fe₃O₄-NPs进行桃胶固定化,使得氢化酶基因表达量增强,与对照相比最大增加34.69±1.97倍,并导致氢化酶和关键酶的基因表达量发生变化,促进了不同阶段的产氢。由此可见,磁性Fe₃O₄纳米颗粒耦合桃胶固定化对Klebsiella sp.氢酶基因表达量具有一定的促进作用,进而调控生物氢的合成。