土壤是高度结构化、由异质性微生境组成的生态系统。据估算,超过80%的土壤微生物粘附在土壤矿物或矿物-有机物复合体表面,形成微菌落或生物膜。生物膜可通过微生物分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)使其获得竞争性优势,如加强细胞间群体感应、协助细胞在表面定殖、缓解外界环境胁迫等。胞外DNA(extracellular DNA,eDNA)作为生物膜基质组分之一,在细菌生物膜的形成发育、结构调控和功能发挥等方面发挥着重要作用。然而,目前eDNA在土壤细菌生物膜中的作用还知之甚少,特别是在分子及单细胞水平上,eDNA对控制细菌生物膜形成与空间结构机制等认识非常有限。因此,本课题选取代表性的土壤细菌-革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌恶臭假单胞菌,综合运用化学分析方法、分子生物学技术以及现代仪器分析手段如激光共聚焦显微镜(CLSM)、结构光照明超分辨显微镜(SIM)、原子力显微镜(AFM)、耗散型石英晶体微天平(QCM-D)、等温滴定微量热仪(ITC)等,探究土壤细菌eDNA释放过程及对生物膜形成影响、生物膜形成初期阶段eDNA对土壤细菌粘附的影响,以及eDNA调控细菌生物膜空间结构构建机制。主要研究结果如下:(1)揭示了不同土壤细菌eDNA释放动态过程及其对生物膜形成的影响机制。枯草芽孢杆菌eDNA释放量随时间变化,由6.21 ng/m L升至75.56 ng/m L,其中27.5%的eDNA位于生物膜基质中;恶臭假单胞菌eDNA释放量随时间变化,由135.05 ng/m L升至328.99 ng/m L,其中81.2%的eDNA位于生物膜基质中。DNA酶I处理显著抑制枯草芽孢杆菌生物膜形成,但对恶臭假单胞菌生物膜形成无显著作用,表明对于不同类型土壤细菌,eDNA在细菌生物膜形成过程中可能发挥着不同的功能。eDNA测序分析显示,枯草芽孢杆菌eDNA片段大小为500 bp左右,其DNA序列与生物膜形成的有关基因相关;而恶臭假单胞菌生物膜中eDNA片段大小为1200 bp以上,其DNA序列与细胞保守区域蛋白基因相关。基于细胞死活染色技术,发现枯草芽孢杆菌生物膜初期主要通过主动分泌方式释放eDNA,而恶臭假单胞菌则是通过细胞裂解方式来释放eDNA。通过CLSM观测及共定位分析结果显示,枯草芽孢杆菌的eDNA会与细胞重叠且形成簇状结构,而恶臭假单胞菌的eDNA与细胞未形成特定结构。上述结果表明,eDNA在生物膜中的空间分布可能是影响细菌生物膜形成的主要原因。进一步结合SIM技术发现枯草芽孢杆菌初期生物膜中eDNA包裹细胞并引导细胞纵向扩增,而恶臭假单胞菌中细胞则无规律聚集,表明枯草芽孢杆菌通过主动释放的eDNA与细胞连接,影响了生物膜的空间结构,从而调控生物膜的形成。(2)阐明了eDNA影响枯草芽孢杆菌在针铁矿表面粘附的机制。在高离子强度条件(100 mmol/L Na Cl溶液)下,表面含有eDNA的枯草芽孢杆菌在针铁矿表面的粘附速率(Δf/Δt)最快且易形成细胞团聚体,DNA酶I处理会显著抑制其细胞粘附速率,而在低离子强度条件(1 mmol/L,10 mmol/L Na Cl溶液)下,eDNA对细菌粘附无显著影响。QCM-D响应模型拟合结果表明,在高离子强度条件下,eDNA的存在使枯草芽孢杆菌与针铁矿之间的接触粘弹性和接触面积分别提高了5.2倍和1.8倍,而在低离子强度下,eDNA的作用不明显。联合ATRFTIR和2D-Co S分析表明,在高离子强度条件下,eDNA有利于细胞与针铁矿之间形成Fe-磷酸/磷酸酯表面复合物,从而促进枯草芽孢杆菌稳定附着于针铁矿表面。随Na Cl浓度由100 mmol/L降至1 mmol/L,表面含有eDNA的细胞表面磷酸二酯键特征峰逐渐减弱,细胞粘附过程中主要是细胞表面多糖相关基团如糖苷键在针铁矿表面优先吸附。结合扩展DLVO(Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek)理论,拟合了不同离子条件下表面有无eDNA细胞与针铁矿的相互作用力,发现表面有eDNA细胞与针铁矿作用过程中,范德华力和静电作用力共同起作用,而表面无eDNA细胞与针铁矿作用过程中,主要由酸碱作用力起主要作用。研究结果为更好理解eDNA在细菌定殖过程中的功能提供了有益借鉴。(3)明确了eDNA与胞外多糖互作在枯草芽孢杆菌生物膜三维结构(3D)构建过程中的作用机制。枯草芽孢杆菌培养12 h后,通过CLSM及Imaris软件分析,发现eDNA将细胞紧密包裹在基质中,形成3D空间结构(eDNA-微菌落复合物);培养24 h后,生物膜空间结构向横向与纵向两个维度扩展,细菌周围的eDNA逐渐减少;48 h后,eDNA均匀地分布在生物膜中。结合共定位分析表明,在枯草芽孢杆菌生物膜发育初期,eDNA与胞外多糖存在协同作用,共同支撑生物膜骨架结构,而当生物膜发育到稳定期时,胞外多糖则成为优势组分,支撑生物膜空间结构。通过构建枯草芽孢杆菌胞外多糖分泌相关基因epsG的缺失突变株,进一步证实了生物膜空间结构构建过程中eDNA与胞外多糖之间的协同作用。epsG的缺失使eDNA与胞外多糖之间的相互作用消失,并导致气液界面生物膜的生物量显著降低。ITC的实验结果也验证了胞外多糖与eDNA之间存在分子间相互作用。上述结果为更好地理解eDNA和胞外多糖之间的相互作用在塑造生物膜3D结构过程中的贡献提供了理论依据。