目的:研究天然产物薯蓣皂苷抗皮肤癌的药理学作用,并对其可能的分子机制进行探讨。材料和方法:1.在体内动物实验中,4-6周龄的BALB/C裸鼠适应性饲养一周后,将皮肤癌细胞株荧光素酶标记的皮肤癌细胞Luc-A431以5×107个/m L悬浮于0.5 m L高压灭菌处理的PBS缓冲液中,皮下注射到小鼠腋下区域,密切关注成瘤情况,随后将接种裸鼠分为空白对照组、薯蓣皂苷给药高、低剂量(80和20mg/kg)给药组共三组,每组5只,连续灌喂给药26天,计算肿瘤体积。最后一次给药后,进行小动物活体成像实验。实验中将建模成功的空白组及给药组(80mg/kg)裸鼠分别注射配制好的荧光素钾盐溶液。随后立即进行异氟烷吸入麻醉,置于成像仪暗箱平台。软件调节成像背景以及视野,等待5分钟至裸鼠体内荧光强度达到峰值,进行拍照,完成成像操作,最后对成像图片进行发光面积的计算。在病理学组织检测分析中,将肿瘤组织包埋在石蜡中,用切片机将其切成5(?)m切片,随后通过脱蜡,苏木精和伊红染色,封片和镜检等步骤进行染色分析,观察肿瘤组织的损伤情况。在免疫组化分析实验中,使用免疫组化二步法试剂盒进行检测,通过脱蜡和水化,抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,滴加封闭用正常山羊血清工作液,孵育一抗,滴加生物素标记山羊抗兔Ig G聚合物,滴加辣根酶标记工作液并进行DAB显色,复染,脱水封片等步骤,最后进行并进行显微镜拍照,观察组织情况。在组织的的免疫荧光分析实验中,将福尔马林固定的肿瘤组织包埋在石蜡中,切成5(?)m切片。将覆盖有p53抗体的组织切片放置于避光湿盒中4摄氏度下过夜,接着加入带有荧光标记的二抗在37摄氏度孵育1小时。细胞核经DAPI(5.0(?)g/m L)染色。免疫荧光的样品通过免疫荧光显微镜随机选择5处拍照,分析图像结果。最后通过western blot实验考察薯蓣皂苷对下游调控细胞迁移、细胞凋亡和DNA损伤信号通路相关蛋白RHO、cdc42、MMP2、MMP9、Cleaved caspase-3/9、Bax,Bcl-2表达的影响。2.在薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞凋亡作用研究实验中,采用MTT法检测薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞的细胞毒性作用。分别配制不同浓度(0.7、1.4、2.9、5.8和11.6(?)M)薯蓣皂苷处理皮肤癌A431细胞不同时间(12、24和36h)后,加入MTT(10mg/ml)10(?)l,37℃孵育4h后,弃上清并加入150(?)l DMSO溶解甲瓒,然后用酶标仪上测定OD值,记录实验结果。同时采用明场条件下的细胞白照实验观察细胞形态变化。平板克隆实验中将对数生长期的皮肤癌A431细胞按2×105个细胞每孔接种于6孔板中,给药组每3天用浓度分别为2.9、5.8和11.6(?)M的薯蓣皂苷处理,空白组每3天更换新鲜培养基。培养2到3周后弃去上清液,4%多聚甲醛室温固定并用1%结晶紫溶液染色。最后用相机对各组进行拍照记录并计算克隆形成率。TUNEL实验和彗星实验考察薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞凋亡和DNA损伤的影响。TUENL实验皮肤癌A431细胞中给予不同浓度的薯蓣皂苷(1.4、2.9、5.8(?)M),过夜孵育后加入浓度为1.0(?)g/m L溶于PBS的吖啶橙(AO)和溴化乙锭(EB)各20(?)L,最后用荧光显微镜进行观察,记录染色和分析凋亡情况。彗星实验中收集对数生长的皮肤癌A431细胞,给予不同浓度的薯蓣皂苷(2.9、5.8和11.6(?)M)处理24 h,按照彗星电泳检测试剂盒的步骤进行制片,铺胶、细胞裂解和电泳等步骤后最后进行荧光显微镜观察照相,任意选取视野后用分析软件Comet assay software project(CASP)进行分析。在凋亡分子机制探究实验中,首先通过Western blot检测相关凋亡蛋白的表达,用含1%PMSF的RIPA裂解缓冲液裂解细胞,BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行ECL显色。最后考察薯蓣皂苷对下游调控细胞凋亡和DNA损伤信号通路相关蛋白ATM,p53、PARP、Cleaved caspase-3/9、Bax,Bcl-2表达的影响。在免疫荧光实验中,收集对数生长期的A431细胞给予不同浓度的薯蓣皂苷(1.4、2.9、5.8(?)M)处理24h。样本用PBS清洗后加入4%的多聚甲醛于室温中固定,用0.2%的Triton-X100通透液进行处理。之后将细胞用脱脂奶粉进行封闭处理,加入一抗并4℃孵育过夜。次日,用PBS清洗两次后再加入二抗FITC-conjugatedgoat anti-rabbit Ig G(1:100)室温避光孵育1h。最后DAPI(1.0μg/m L)染色15min,PBS清洗后,用荧光显微镜观察照相。在p53si RNA体外转染实验中p53 si RNA和control si RNA分别溶解后与lipofectamin 2000试剂混合形成脂质体抑制剂复合物。转染24 h后检测细胞活力、细胞凋亡程度和DNA损伤程度以及p53、PARP、Cleaved-Caspase3/9、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平。3.在薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞迁移和侵袭作用研究实验中,采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测薯蓣皂苷对细胞迁移和侵袭能力的影响。细胞划痕实验中用移液枪在长满皮肤癌A431细胞的板底上垂直划过形成一条没有细胞的划痕,之后给予不同浓度的薯蓣皂苷(2.9、5.8和11.6(?)M)处理24 h过夜后,用4%的多聚甲醛固定并在显微镜下观察,通过划痕宽度的改变来判断细胞迁移的能力。Transwell侵袭实验中将胰酶消化后的皮肤癌A431细胞离心弃上清,加入不含胎牛培养液使其重悬,在上室加200(?)L(3×104个/室)细胞悬液,随后给药组给予不同浓度的薯蓣皂苷(2.9、5.8和11.6(?)M)的不加胎牛血清的培养基,小室下面为加500(?)L新鲜培养基,其中包含10%胎牛血清。在37℃、5%CO2条件下24 h过夜后取出小室,PBS清洗后用结晶紫染色30 min,显微镜随机选取视野来进行拍照并且对细胞进行计数。随后通过Western blot检测迁移和侵袭相关蛋白的表达,用含1%PMSF的RIPA裂解缓冲液裂解细胞,BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行ECL显色。最后考察薯蓣皂苷对下游调控细胞迁移侵袭信号通路相关蛋白RHO、cdc42、MMP2、MMP9表达的影响。在p53si RNA体外转染实验中p53 si RNA和control si RNA分别溶解后与lipofectamin 2000试剂混合形成脂质体抑制剂复合物。转染24 h后检测细胞迁移侵袭能力以及RHO、cdc42等迁移侵袭蛋白表达水平。结果:1.体内移植瘤实验结果表明薯蓣皂苷能有效抑制裸鼠瘤体积和重量的变化,80mg/kg薯蓣皂苷治疗后接种皮肤癌A431细胞,裸鼠瘤体积和重量分别减少了80.4%和73.3%。免疫荧光结果显示薯蓣皂苷能显著上调靶蛋白p-ATM、p53、PARP和cleaved-caspase-3,Western blot结果显示薯蓣皂苷能显著上调p53、PARP、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9和Bax蛋白表达水平,同时显著下调RHO、cdc42、MMP2、MMP9和Bcl2表达水平。2.MTT实验结果表明,与空白组相比,薯蓣皂苷处理组中薯蓣皂苷显著降低了皮肤癌A431细胞活力;平板克隆实验证明薯蓣皂苷能抑制细胞增殖能力,TUNEL实验的彗星电泳实验表明薯蓣皂苷能诱导皮肤癌A431细胞凋亡及DNA损伤。进一步p53si RNA转染实验结果表明薯蓣皂苷对皮肤癌A431凋亡和DNA损伤的药理作用,可能是通过调控p53介导的迁移侵袭信号通路产生的。3.划痕实验和Transwell实验证明薯蓣皂苷能抑制细胞迁移和侵袭能力,体外分子机制实验结果表明薯蓣皂苷调节皮肤癌A431细胞中Rho、cdc42、MMP2、MMP9等迁移相关蛋白的表达,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭的发生。进一步p53si RNA转染实验结果表明薯蓣皂苷对皮肤癌A431迁移侵袭药理作用,可能是通过调控p53介导的迁移侵袭信号通路产生的。结论1.薯蓣皂苷能显著抑制皮肤癌A431细胞荷瘤裸鼠肿瘤的生长。薯蓣皂苷通过调控ATM/p53通路,调节皮肤癌A431细胞中p53、caspase等凋亡相关蛋白的表达,诱导肿瘤组织中细胞的凋亡;通过调节Rho、cdc42等迁移相关蛋白的表达,抑制肿瘤组织中细胞迁移和侵袭。2.薯蓣皂苷能显著促进皮肤癌A431细胞的凋亡和DNA损伤产生,且呈剂量依赖性。并且这种作用是通过调控凋亡和DNA损伤相关蛋白ATM、p53、PARP、Cleaved-Caspase3/9、Bax、Bcl-2的表达实现的。3.薯蓣皂苷能显著抑制皮肤癌A431细胞的迁移和侵袭的发生,且呈剂量依赖性。并且这种作用是通过调控迁移和侵袭相关蛋白Rho、cdc42、MMP2、MMP9的表达实现的。综上所述,薯蓣皂苷具有很好的抗皮肤癌作用,这种作用是通过上调p-ATM和p53表达,进而调控细胞凋亡、细胞迁移和DNA损伤蛋白信号通路来实现的。总之,薯蓣皂苷在抗皮肤癌方面具有较大的研究和开发价值。