生物冶金工艺由于其具有成本低、操作简便、回收率高和环境友好等优点,而被广泛应用于低品位、难处理矿石的开采。由于生物冶金过程是一个重金属离子不断溶出和积累的过程,尤其在生物冶金的中后期,浸矿体系中高浓度的有毒重金属离子成为制约生物冶金效率的重要因素。铜矿作为采用生物冶金技术开采最多的矿产资源,其浸出效率难免受到浸出体系中高浓度铜离子的影响,因此,构建稳定遗传的高抗铜基因工程菌将是解决上述问题的有效途径。但是高抗铜菌株的构建则依赖于浸矿微生物的铜抗性机制的研究。嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans,A.thiooxidans)是一类极端嗜酸性的专性化能白养γ-变形杆菌,能够在重金属离子含量较高的环境中生存。该类菌通过氧化单质硫和还原态无机硫化合物获得生长繁殖所需的能量和还原力,已被广泛应用于生物冶金、生物修复、生物脱硫以及碱性土壤酸化等行业。但是由于缺乏有效的遗传操作手段以及完整的基因组测序信息等因素,使得该类菌的铜抗性机制研究尚处于空白阶段。本文旨在A.thiooxidans中建立高效无痕的基因敲除和整合体系以及深入研究和揭示A.thiooxidans的铜抗性机制。本文通过在嗜酸性硫杆菌中对β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)、半乳糖激酶基因(galK)、增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)四种报告基因进行了表达验证以及应用比较,为嗜酸性硫杆菌的基因功能研究提供了可选的报告基因,为在嗜酸性硫杆菌中建立基于负筛选标记的高效无痕基因敲除技术奠定了基础。在A.thiooxidans中成功建立了基于同源重组原理、酵母限制性内切酶I-Scel和负筛选标记的高效无痕基因敲除和整合体系,显著提高了二次交换的同源重组频率(0.28±0.048)和突变株的筛选效率,为该类菌的能量代谢、物质代谢和抗逆机制等研究以及遗传改造搭建良好的技术平台。利用建立的高效无痕基因敲除体系成功实现了cueO基因、cusCBA基因簇和copA基因的敲除,并利用建立的高效无痕基因整合体系成功实现了外源基因(copBAf、PTgusA和PcopA-gusA)的整合和内源基因(copAt和cueZ)的倍增。通过分析A.thiooxidans ATCC 19377的基因组草图注释信息,发现一个编码多铜氧化酶的基因(AthiA1₀10100013518)(GenBank:KF998570)。通过同源比对、功能预测、结构域比对分析、Tat信号肽预测和亚细胞定位等生物信息学分析,结果显示:KF998570蛋白可能与E.coli来源的CueO具有类似的功能。进一步通过启动子分析和活性测定、以及野生型菌株和△cueO突变株的铜离子耐受性和酚氧化酶活性比较,结果显示:(1)PcueO启动子对铜离子的响应强度显著高于其它重金属离子;(2)AcueO突变株的铜离子耐受显著低于野生型菌株;(3)△cueO突变株几乎完全丧夫了酚氧化酶活性,而以质粒形式对△cueO突变株进行回补后,回补菌株AcueO(pJRD215-cueO)的酚氧化酶活性得到恢复,说明与其他多铜氧化酶一样,A.thiooxidans的多铜氧化酶(CueO)同样具有典型的酚氧化酶活性。以上结果说明CueO应该与A.thiooxidans的铜抗性相关。通过分析d.thiooxidans ATCC 19377基因组注释信息,找到一个可能编码copper-translocating P-type ATPase 的基因 AthiAl₀10100003253(GenBank:WP₀10637963),通过分析WP₀10637963蛋白的亚细胞定位以及与其它来源的铜离子转运P-型ATPase的功能结构域相似性,结果显示:该蛋白可能与A.thiooxidons胞内铜离子平衡有关。进一步对该蛋白编码基因(copA)进行转录差异表达测定、以及启动子分析和活性测定,发现capA基因对铜离子的响应强度显著高于其它重金属离子。通过比较野生型菌株、copA基因敲除突变株AcopA、copA基因过表达菌株和△copA突变株回补菌株之间的铜离子耐受性,结果显示:△copA突变菌株几乎完全丧失了铜抗性;当以质粒的形式对AcopA突变进行回补株时,回补菌株的铜抗性不仅得到恢复而且显著提高,抗铜浓度比△copA突变株提高至少50 mMc通过比较野生型菌株和copA基因倍增菌株A.thiooxidans copAAt的胞内铜离子滞留情况,发现具有高铜抗性的A copAAt菌株的胞内铜离子滞留量显著低于野生型菌株。以上结果表明CopA具有铜离子外排的功能并且该蛋白在A.thiooxidans ATCC 19377的铜抗性中发挥至关重要的作用。在A.thiooxidans ATCC 19377的基因组上有一个注释为 MerR family transcription regulator 的调控基因 AthiA1₀10100011711(GenBank:WP₀10641489)和一个可能编码铜分子伴侣的基因AthiA1₀10100011716(GenBank:WP₀10641491)组成的基因簇,通过功能预测、系统发育分析、结构比对以及基因遗传背景分析等生物信息学分析,初步推测WP₁0641489蛋白可能为铜响应转录调控因子(CueR),WP₀10641491蛋白为铜分子伴侣蛋白(CueZ)。进一步研究了CueR蛋白对cueO、copA和cueR的转录调控作用,结果显示:CueR蛋白对cueO基因具有转录激活作用,对其自身编码基因的转录表达具有自我抑制的作用,而对copA基因则无调控作用。同时对cueR基因启动子的活性分析和测定结果显示:cueR基因的启动子PcueR有较强的启动子活性,其启动强度与Ptac强启动子的启动强度几乎在同一个水平;相比其它金属离子(尤其是锌离子),PcueR启动子对铜离子具有更高的响应强度和响应特异性。说明WP₀10641489蛋白的确为铜离子响应而非锌离子响应的调控因子(CueR)。但是,经过大量的cueR基因敲除实验未能获得△cueR敲除突变株,初步推测CueR蛋白可能在A.thiooxidans的基本生命活动中发挥不可缺少的作用,其缺失突变可能导致菌体死亡。木文还通过构建PTcueZ融合片段整合菌株A.thiooxidans PTcueZ和AcopA::PTcueZ,并测定和比较不同菌株之间的铜离子耐受性差异,结果显示:A.thiooxidans PTcueZ菌株的铜抗性比野生型菌株略微提高,但是PTcueZ基因片段的整合并未提高△copA突变株的铜抗性,因此,推测CueZ蛋白在d.thiooxidans铜扰性中可能发挥结合铜离子并将其传递给CopA的功能。通过对A.thiooxidans ATCC19377的基因组注释信息进行系统的分析,获得了一些可能与A.thiooxidansATCC 19377铜抗性直接或间接相关的基因,并测定了经不同浓度铜离子刺激后,A.thiooxidans ATCC 19377野生型株和copA基因缺失突变株△copA中这些基因的差异表达情况。根据每个基因的功能预测、铜离子刺激下的差异表达以及某些基因的功能验证结果,绘制了A.thiooxidans ATCC 19377铜抗性机制模式图。根据A.thiooxidans ATCC 19377和A.ferrooxidans ATCC 23270的铜抗性机制研究结果,本文通过基因整合的方法构建了稳定遗传的A.thiooxidans PAgusA铜离子生物传感器以及高效抗铜基因工程菌A.thiooxidans copAAt和Athiooxidans copBAt,研究比较了野生型菌株和高抗铜基因工程菌之间的浸矿效率差异,实验结果显示:在人为加入20 mM外源铜离子的浸矿体系中,高抗铜基因工程菌的铜生物浸出效率高于野生型菌株,说明浸矿微生物铜抗性与浸矿效率之间存在一定的正比关系;并且初步探索了A.thiooxidans PAgusA生物传感器在铜离子检测中的应用。