抗生素抗性的高频出现成为全球公共卫生领域高度关注的环境污染问题。研究认为抗生素抗性基因(ARGs)的环境选择性来源于畜禽养殖过程中过量使用而导致的抗生素或金属残留。在本研究中,我们针对三个商业化家禽养殖场进行研究,比较了与ARGs相关的抗生素和金属残留的共存模式。另外,我们还验证了一种使用LC-MS/MS测定抗生素浓度的方法。1.优化并验证了一种同时萃取和纯化的方法即串联四重质谱(LC-MS/MS)液相色谱法来测定沉积物中的多类抗生素。该方法针对头孢菌素,氟喹诺酮,林可酰胺,大环内酯,硝基咪唑,喹诺酮,磺酰胺和四环素类的40种抗生素测定进行了优化。该优化方法包括先用5 ml Mcllvaine缓冲液水合冻干的沉淀物样品,然后使用10 ml MeOH和MeCN(1:3,v/v)的混合物进行萃取。通过MgSO4(4 g)和NaCl(1 g)进行盐析并在10,000 rpm条件下离心5分钟,从而实现水相和有机萃取相之间的液-液分配。在进行LC-MS/MS 之前,用 100 mg C18 和 PSA(1:2 w/w)以及 50 mg MgSO4的混合物对有机提取物的等分试样(1ml)进行分散固相萃取,再通过0.22 μm注射过滤器过滤。根据欧盟2002年的标准(2002/657/EC),使用从饮用水水库获得的空白沉淀物样品,对10、20、50和100 μg kg-1峰值水平下的测定方法进行了验证。该方法在LC-MS/MS分析过程中产生的纯净提取物的基质效应通常较低。对于10、20、50和100 μg kg-1的加标水平,抗生素的回收率介于24-162%,31-151%,35-176%和 35-188%之间,且大多数情况下位于可接受精度(RSD>20%)范围之内。该分析方法很灵敏,分别达到0.004-7.7 μg ml-1和0.01-25.6 μg ml-1的检出限和定量限。在考虑精准度的前提下,通过测定以10、20、50和100μg kg-1浓度加标的复杂固体基质(鸡粪,家禽饲料和土壤)来确定该方法的适用范围。该方法同样适用于残留样品的抗生素分析,在沉积物,鸡粪,土壤和家禽饲料样品中均检出了氟喹诺酮,大环内酯,磺酰胺和四环素抗生素的残留。2.带有金属添加剂的家禽饲料通过为抗生素抗性提供长期协同的选择性压力来污染环境。为了验证这一假设,我们使用ICP-MS测定了家禽场样品中重金属Zn,Cu,As,Ni,Cd,Pb和Cr的浓度,并使用Pearson相关矩阵分析了数据。在所有农场中,土壤中Zn的浓度最高,分别为 39.05-123.37 mg kg-1、46.17-394.47 mg kg-1 和61.39-990.57 mg kg-1;其次是Pb,在“B”农场和“C”农场中的浓度分别为 33.44-618.22 mg kg-1 和 111.08 mg kg-1。Zn、Cu、Cd 和 Ni在饲料样品中最大含量范围分别为103.09-304.29 mg kg-1、6.48-178.87 mg kg-1、4.15-5.46 mg kg-1 和 3.35-4.53 mg kg-1,这一结果令人震惊。在“B”农场中,粪肥中的Zn含量最高,为 287.29 mg kg-1-1103.09 mg kg-1,其次是 Cu 28.64 mg kg-1-273.25 mg kg-1 和 Cd 0.46 mg kg-1-16.36 mg kg-1。Cr,Ni和Pb的含量均在安全范围内。皮尔逊相关矩阵分析表明,39个土壤样品中,Ni和Cr之间具有很强的相关性(r=0.983,P<0.01)。42份饲料样品中Zn和As(r=0.749,P<0.01)及 Zn 和 Cu(r=0.684,P<0.01)之间的相关性均呈显著正相关。在粪肥中,Zn和Cu(r=0.846,P<0.01)以及Ni和Cu(r=0.874,P<0.01)之间也呈现显著的正相关关系。这些结果证明家禽饲料中的金属滥用会造成环境污染。3.ARGs是全球公认对人体健康造成威胁的的新兴污染物。高密度养殖的牲畜是ARGs传播的主要贡献者,而抗生素和金属残留物为环境中的ARGs提供了选择压力。我们还进行了基于16S rRNA的微生物群落分析,以深入了解微生物群落对ARGs的影响。对于微生物群落的结构和组成,我们扩增了 V4-V5区域,使用UCHIME算法获得clean reads,并通过QIIME(版本1.7.0)进行了深入分析。基因组DNA中16S rRNA基因的丰度范围为每克4.22x106至2.16x108个基因拷贝数和5627个OTU,其中细菌(99.92%),古细菌(0.07%)和其他(0.0002%)。分析数据发现变形杆菌在土壤和粪肥中均占主导,蓝细菌在饲料中占主导,而粪便样本中的拟杆菌和厚壁菌丰度较高。通过这项研究证明了禽场环境中抗生素和重金属残留与ARGs的共存情况及关系,我们获得了三个商业化禽场中ARGs的类型和浓度。4.我们定量测定了 284种抗生素抗性基因(ARGs),12个可移动遗传元件(MGEs),49种残留抗生素和7种重金属,并对16S rRNA基因进行了测序。粪肥中ARGs的丰度和种类显著增加,而土壤样品中的细菌群落多样性最丰富。Procrustes分析表明,基于ARGs/MGE的丰度与微生物群落间的显著相关性,ARGs和MGEs至少部分源自细菌。镉,砷,锌,铜和铅与ARGs和抗生素呈正相关,而与金属相比,抗生素与ARGs并不显著相关。整合子和转座子与9类抗生素相对应的ARGs共同出现,尤其是1类整合酶intl-1LC。冗余分析和方差分配分析表明,抗生素、金属、MGEs和细菌分别只能解释0.7%,5.7%,12.4%和21.9%的ARGs组成变化。这些结果表明细菌群落组成和水平基因转移是影响ARGs组成的主要因素。而与本项研究中检测的抗生素相比,金属对ARGs的影响更大。5.本课题组从中国紫金金铜矿中分离出一株高重金属抗性的菌株Cupriavidus metallidurans BS1。由于被广泛研究且与之密切相关的菌株C.metallidurans CH34被证明不仅具有很高的重金属耐受性,而且还能够还原金属络合物并将其生物矿化成金属纳米颗粒(包括金纳米颗粒),因此认为,本课题组分离得到的株菌BS1具有很大的研究意义。基于上述原因对该菌进行了鉴定,使用PacBio平台对其完整的基因组进行测序,并与CH34进行基因组比较。结果显示BS1与CH34具有广泛相似之处,并鉴定出许多重金属抗性决定簇。但是,BS1和CH34均显示出广泛的基因组可塑性,这可能是造成这些菌株之间显著差异的原因。BS1包含三个原噬菌体,虽然它们可能是BS1中主要的重金属抗性决定簇从质粒转移至染色体(CHR2)的原因,但并不存在于CH34中。令人惊讶的是,BS1中的单个质粒-pBS1(364.4 kbp)仅包含一个重金属抗性决定簇,即czc决定簇,代表了 RND型外排系统,赋予了 BS1对钴、锌和镉的抗性,该决定簇与在C.metallidurans CH34中位于pMOL30上的决定簇具有很大的相似性。然而,在BS1的染色体上鉴定出另一个同源的czc决定簇,且最类似于CH34中来自pMOL30的czc决定簇。位于CH34中大质粒pMOL28上的其他重金属抗性决定簇,例如cnr和chr决定簇,与BS1的染色体上的czc决定簇(CHR2)相邻。此外,其他重金属抗性决定簇(例如pbr,cop,sil和ars)位于染色体(CHR2)上,而不位于BS1中的pBS1上。由于分离自不断暴露于高浓度铜、金和其他重金属的样品中,该菌株发生了各种各样的基因组重排。相比之下,BS1中的大质粒主要包含众多编码未知功能基因的序列,因此可能更像是一个进化场所,可以通过水平基因转移获得有用的基因,并可能改组以帮助C.metallidurans BS1承受环境中极端浓度重金属的强烈压力。