目的:本实验从张景岳之“阴阳互济”理论出发,选取中医经典补肾填精方剂左、右归丸并将其拆方,以两方的共有药为共同方组,以左归丸中滋阴药为滋阴方组,以右归丸中补阳药为补阳方组,以雌二醇戊酮片为阳性对照组,以绝经后骨质疏松症(PMOP)大鼠BMSCs为研究对象,着重观察左、右归丸及其拆方水煎液在PMOP大鼠体内代谢后提取的BMSCs的成骨分化潜能,并从ERK1/2信号通路途径探讨左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs成骨诱导的可能机制。材料与方法:采用双侧去卵巢法建立绝经后骨质疏松症模型,SPF级2月龄Sd雌性未生育大鼠90只,200-220g,适应性喂养1周后按数字随机法随机分为正常组10只、假手术组10只和手术组70只,正常组继续常规饲养,手术组实施双侧去卵巢手术造模处理。术后3天,将行双侧切除卵巢术后存活的大鼠再次按体重分层随机分为7组,最后的分组结果为正常组(Control)10只、假手术组(Sham)10只、模型组(OVX)、补佳乐组(BJL)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、共同药方组(GTY)、滋阴药方组(ZYY)和补阳药方(BYY)组各8只。按每kg体重大鼠的给药量为人的6.3倍计算,并且每次给大鼠灌胃量为正常人用药量的2倍,每日灌胃1次,空白对照组、假手术组、模型组均灌服蒸馏水,其余各组分别灌服各组相应制备好的药液。给药12周后分别提取各组大鼠BMSCs,采用MTT法检测BMSCs增殖率,PNPP法检测BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性,采用改良钙钴法检测ALP活性,茜素红法观察矿化结节的形成,并用Quantitative real-time PCR法检测核心结合因子(Cbfα1)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)m RNA表达,用Western blot法检测Cbfα1、ColⅠ蛋白表达。另外,采用ERK1/2、MAPK信号阻滞剂方法,以PD98059(ERK1/2特异阻滞剂)干预PMOP大鼠BMSCs,并用Quantitative real-time PCR法检测Cbfα1、ColⅠm RNA表达,用Western blot法检测Cbfα1、ColⅠ、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达。结果:1.BMSCs的鉴定经流式细胞仪检测,各组BMSCs的CD29、CD90表达均为阳性,且CD29的阳性率均在94%以上,CD90的阳性率均在50%以上。CD45表达为阴性,其中OVX和BJL组的阴性率在30%以下,其余各组的阴性率在6.4%以下。2.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs增殖的影响2.1 BMSCs生长曲线绘制BMSCs生长曲线大体呈S形,接种后第1~2d为潜伏期,从第3d细胞开始增殖并进入对数生长期,第5~6d达到高峰,以后进入平台期。2.2左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs增殖的影响结果显示,左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs的促增殖作用呈时间相关性。在第1d时,与Control组比较,OVX、ZGW、ZYY、BJL组有显著性差异(P<0.05),而各组与OVX组比促增殖作用无显著性差异(P>0.05)。第3d时,与Control组比,ZGW、YGW、ZYY与BJL组有显著性差异(P<0.05),只有BJL组与OVX组比有显著性差异(P<0.05)。第5d时,OVX、ZGW、YGW、GTY与BJL组与Control组比较都有统计学意义(P<0.05),同第3d一样只有BJL组与OVX组比有显著性差异(P<0.05)。第7d时,与Control组及OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组均有显著性差异(P<0.05),与ZGW组比较,Sham、GTY、ZYY、BYY组有有统计学意义(P<0.05)。3.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs成骨诱导及分化的影响3.1.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs ALP的表达的影响以PNPP法检测PMOP大鼠BMSCs ALP活性,可以明显看出ZGW组在7d时ALP活性最高,且加药各组在7d时ALP活性均高于其他时间。其中ZGW组ALP活性在4个时间段与Control、OVX组比较均有显著性提高(P<0.05);YGW组ALP活性在1d、5d、7d时与Control、OVX组比较著性提高(P<0.05);而BJL组在1d、3d时与Control、OVX组比较著性提高(P<0.05),在5d时只与Control组比较有明显提高(P<0.05),在7d时与Control、OVX组比较已无显著性差异(P>0.05);GTY、ZYY、BYY组与Control、OVX组比较,ALP活性在不同的时间偶有不同程度的提高(P<0.05)。以改良钙钴法检测PMOP大鼠BMSCs ALP表达,BMSCs里的ALP由改良钙钴法染色后,呈棕黑色颗粒状并聚集在一起,阴性对照无棕黑色颗粒。结果显示,与Control组比,OVX、Sham组细胞突触有回缩的趋势,棕黑色颗粒沉积明显减少,其他各组细胞密度增大,细胞突触多且长,棕黑色颗粒增多,并且不难看出其中尤以ZGW和YGW组较突出,而ZGW组棕黑色颗粒有明显多于YGW组。3.2左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs矿化结节的影响BMSCs形成的钙化结节由茜素红染完色后呈红色。结果显示,与Control组比,OVX、Sham、GTY和BYY组钙化结节明显减少,而ZGW、YGW、ZYY和BJL组钙化结节明显增多。与BJL组比较,ZGW、YGW组钙化结节明显增多。3.3左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs Cbfα1、ColⅠm RNA及蛋白表达的影响3.3.1左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs Cbfα1 m RNA及蛋白表达的影响结果显示:与Control组比较:OVX组BMSCs中Cbfα1 m RNA表达显著减少(P<0.05);ZGW和BJL组能显著上调BMSCs中Cbfα1 m RNA的表达(P<0.05),且ZGW组高于BJL组;YGW组可明显上调Cbfα1 m RNA的表达(P<0.05)。与OVX组比较:ZGW、YGW、BJL组可显著提高BMSCs中Cbfα1 m RNA的表达(P<0.05)。与ZGW组比较:YGW组BMSCs中ColⅠm RNA的表达偏少(P<0.05),而GTY、ZYY、BYY组中BMSCs Cbfα1 m RNA的表达均有不同程度的减少(P<0.05)。与Control组比较:Sham、ZGW、YGW、BJL组BMSCs中Cbfα1蛋白表达无显著性差异(P>0.05),而OVX、GTY、ZYY、BYY组BMSCs中Cbfα1蛋白表达显著降低(P<0.05);与OVX组比较,ZGW和Sham组能明显上调BMSCs中Cbfα1蛋白表达(P<0.05),其余组无显著差异(P>0.05)。与ZGW组比较,YGW、GTY、ZYY、BYY、BJL组BMSCs中Cbfα1蛋白表达显著减少(P<0.05)。3.3.2左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs ColⅠm RNA及蛋白表达的影响结果显示:与Control组比较:OVX组BMSCs中ColⅠm RNA及蛋白表达显著减少(P<0.05),ZGW和BJL组能显著上调BMSCs中ColⅠm RNA的表达(P<0.05),且ZGW组高于BJL组;而ZGW、YGW、GTY、ZYY组能显著提高BMSCs中ColⅠ蛋白的表达(P<0.05),且ZGW组高于YGW组;与OVX组比较:ZGW、YGW、BJL组可显著提高BMSCs中ColⅠm RNA的表达(P<0.05);ZGW、YGW、GTY、ZYY、BYY组可显著提高BMSCs中ColⅠ蛋白的表达(P<0.05)。与ZGW组比较:YGW组BMSCs中ColⅠm RNA的表达偏少(P<0.05),而GTY、ZYY、BYY组中BMSCs ColⅠm RNA的表达均有不同程度的减少(P<0.05);BYY和BJL组BMSCs中ColⅠ蛋白的表达显著降低(P<0.05)。4.ERK1/2信号通路干预左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠BMSCs成骨诱导的研究4.1 ERK1/2信号通路对左、右归丸其拆方干预PMOP大鼠BMSCs Cbfα1 m RNA及蛋白表达的影响结果显示,与Control组比较:OVX组BMSCs中Cbfα1m RNA表达显著减少(P<0.05);ZGW、YGW、GTY和BYY组能显著上调BMSCs中Cbfα1m RNA的表达(P<0.05)。与OVX组比较:ZGW、YGW、GTY、ZYY、BYY、BJL组可显著提高BMSCs中Cbfα1、m RNA的表达(P<0.05),此二者与前面实验结果一致。加入PD98059阻滞剂后,从下图可以看出,ZGW、YGW、GTY、ZYY组在加入PD98059阻滞剂后BMSCs中Cbfα1m RNA的表达与Control组比较无显著性差异(P>0.05),而Control、BYY和BJL组在加入PD98059阻滞剂后与Control组比较BMSCs中Cbfα1m RNA表达有了明显的降低(P<0.05)。而ERK1/2信号通路对左、右归丸其拆方干预PMOP大鼠BMSCs Cbfα1蛋白表达的影响,结果显示,与Control组比较:ZGW、YGW、BYY、BJL组BMSCs中Cbfα1蛋白表达无显著性差异(P>0.05),而OVX、Sham、GTY、ZYY组BMSCs中Cbfα1蛋白表达显著降低(P<0.05);与OVX组比较,ZGW和BJL组能明显上调BMSCs中Cbfα1蛋白表达(P<0.05),其余组无显著差异(P>0.05),此二者与前面实验结果相符。加入PD98059阻滞剂后,Control、组与没有加阻滞剂时相比BMSCs中Cbfα1蛋白表达有了明显的降低(P<0.05),而ZGW、YGW和BYY组在加入PD98059阻滞剂后BMSCs中Cbfα1蛋白的表达与Control组比较也有所降低(P<0.05)。4.2 ERK1/2信号通路对左、右归丸其拆方干预PMOP大鼠BMSCs ColⅠm RNA及蛋白表达的影响结果显示,与Control组比较:OVX组BMSCs中ColⅠm RNA表达显著减少(P<0.05);ZGW、YGW、GTY和BJL组能显著上调BMSCs中ColⅠm RNA的表达(P<0.05)。与OVX组比较:ZGW、GTY、BJL组可显著提高BMSCs中ColⅠm RNA的表达(P<0.05),此二者与前面实验结果一致。加入PD98059阻滞剂后,从下图可以看出,ZGW、YGW、GTY、ZYY组在加入PD98059阻滞剂后BMSCs中ColⅠm RNA的表达与Control组比较无显著性差异(P>0.05),而Control、BYY和BJL组在加入PD98059阻滞剂后与Control组比较BMSCs中ColⅠm RNA表达有了明显的降低(P<0.05)。结果显示,与Control组比较:OVX、Sham、ZYY、BYY、BJL组BMSCs中ColⅠ蛋白表达无显著性差异(P>0.05),而ZGW与YGW组显著提高了BMSCs中ColⅠ蛋白表达(P<0.05)。与OVX组比较,ZGW、YGW、BYY和BJL组能明显上调BMSCs中ColⅠ蛋白表达(P<0.05),GTY和ZYY组无显著差异(P>0.05),这也与前面的实验结果相一致。而加入PD98059阻滞剂后,除Sham外,与Control组比较其余各组加入阻滞后BMSCs中ColⅠ蛋白的表达均显著减少(P<0.05)。4.3 ERK1/2信号通路对左、右归丸其拆方干预PMOP大鼠BMSCs ERK1/2蛋白磷酸化作用的影响与Control组比较,明显ZGW、YGW、BYY和BJL组诱导ERK1/2蛋白磷酸化作用更强(P<0.05)。与OVX组比较,ZGW、YGW和BJL组对ERK1/2蛋白的磷酸化作用增强(P<0.05)。而在加入PD98059阻滞剂之后,Control组与OVX组较没有加入阻滞剂时的Control组比较,诱导ERK1/2蛋白的磷酸化作用明显减弱(P<0.05),而ZGW组在加入PD98059阻滞后与未加之前比较诱导ERK1/2蛋白磷酸化作减弱但是与未加阻滞剂的Control组比较诱导ERK1/2蛋白磷酸化作用明显增强(P<0.05)。结论:1.PMOP大鼠BMSCs的成骨增殖与分化能力下降。2.左、右归丸及其拆方可促进PMOP大鼠BMSCs增殖和分化,并且左、右归丸促进BMSCs成骨分化作用较其拆方更佳,而左归丸与右归丸相比左归丸促进作用更强,说明有“阳中求阴”及“阴中求阳”之义的左归丸与右归丸促进成骨作用明显要优于单一补阳或补阴的滋阴方、补阳方。3.左、右归丸及其拆方促进PMOP大鼠BMSCs成骨分化可能是通过调节或者改善ERK信号通路完成的,这可能是左、右归丸防治绝经后骨质疏松症的机制之一。